气相色谱-质谱（GC-MS）测定猪尿中莱克多巴胺残留

   β-兴奋剂（β-Agonists）结构及功能类似于肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，莱克多巴胺是β-兴奋剂的一种，它既可以作为兽药来治疗家畜的疾病，又能促进动物生长，特别是对提高畜禽瘦肉比率，减少脂肪沉积具有明显作用，应用β-兴奋剂获得更高的瘦肉具有一定的经济意义。但由于β-兴奋剂易在动物内脏（肝、肾等）中积聚残留，并可通过食物链进入人体，严重危害人类健康。随着全球一体化趋势的加快，世界各国加快了技术壁垒的设置，以阻止国外产品的长驱直入，除美国FDA批准可以使用莱克多巴胺外，现欧盟已禁用该药。2002年我国农业部、卫生部、国家食品药品监督管理局规定禁止使用莱克多巴胺。对于莱克多巴胺，目前国内还没有有效的检测方法，控制非法使用的难度相对较大。

   目前实验室中检测莱克多巴胺的方法，最普遍的是ELISA法。此法样品前处理简单，尿液可直接稀释后检测。但是此方法由于交叉反应和样品背景的干扰，假阳性几率高，并且不能用来最后定性。本实验通过对尿样前处理，进行气质联用测定，达到确证目的。

    1.实验

    1.1 主要仪器和试剂

   Agilent6890-5973I气质联用仪；色谱柱J&WDB5-5MS30m×0.25mm×0.25μm；Supelco公司VisiprepTM固相萃取装置；固相萃取（SPE）柱；Waters Oasis MCX(3cm，3ml，60mg)(Waters公司)；β-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酸酯酶混合溶液30U/mL（德国Merck公司）；双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)(美国Supelco公司)；莱克多巴胺标准品（Sigma公司纯度≥99.5%）以甲醇配制；其余试剂为市售分析纯。

    1.2 溶液配制

   乙酸胺缓冲液（pH5.2）：称取1.45g乙酸胺溶于500～700mL水中，用乙酸调整pH值为5.2，定容至1L，该缓冲液临用前配制；0.1mo/L盐酸溶液：量取9mL盐酸，用水定容至1000mL。

    1.3 GC-MS分析条件

   载气：高纯氦气（纯度99.999%），流速0.9mL/min；柱温程序：70℃(保持1min)，以25℃/min升温至200℃(保持7.7min)，以25℃/min升温至280℃(保持4min)；进样口温度：280℃；GC-MS接口温度：250℃；进样方式：不分流进样（1min后开阀）；进样量：1μL；溶剂延迟时间：9.5min；离子源温度为200℃；电离方式：电子轰击；电子轰击能量：70eV；电子倍增器电压：350V；采集方式：选择离子监测（SIM）；Ractopaminem/z（179，250，267，502）出峰时间19.47min。

    1.4 分析步骤

   提取：准确量取2.5mL猪尿于10mL离心管中，调pH值5～6，加入1mL乙酸胺缓冲溶液，在混匀器上旋涡振荡1min，加入50μLβ-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酸酯酶混合溶液，再次振荡混匀，放超声波中超声15min后，放入37℃的恒温箱中酶解18h。取出后以4000r/min速度离心10min，待净化。

    净化：将OasisMCX柱装在固相萃取装置上，用2mL甲醇、2mL水平衡该柱。取上述样液，加至柱子中，靠重力作用过柱。等样液全部过柱后，依次用2mL水、2mL0.1mol/L盐酸溶液、2mL甲醇淋洗柱子,在淋洗液全部流过固相萃取柱后，保持抽气5min，待柱子干枯后，用5mL4%氨化甲醇洗脱被测物于5mL具塞玻璃试管中，在氮吹干仪上，用低于50℃的水浴中氮气吹干。

    衍生化：向残渣加入100μL甲苯，振荡使其溶解后再加入100μLBSTFA，加盖并于旋涡混合器上震荡1min，放入80±2℃的烘箱中加热1h，取出后在氮气流下吹干溶剂，用0.5mL甲苯溶解，进行GC-MS分析。

    2.结果与讨论

   作为β-受体兴奋剂，莱克多巴胺对β-受体有很好的选择性，对体内物质代谢的作用较强，降低脂肪的生成和促进脂肪的分解，促进蛋白质的合成并使其降解减少；还能促进胰岛素的释放，使糖原分解增加，因此能利用合成脂肪的能量和成分来增加蛋白的合成。莱克多巴胺作营养重分配剂，其主要作用机制是其与β-受体结合后引起受体兴奋，激活腺苷酸环化酶，生成cAMP，作为第二信号使触发一系列瀑布式的生化反应，从而达到营养再分配的目的。莱克多巴胺先与细胞膜结合，使皮下脂肪中cAMP含量显著增加，进而通过cAMP刺激脂肪分解，抑制脂肪合成。

   莱克多巴胺在动物的肝、肺、肾、脾等内脏器官中残留量较高。人体摄入残留莱克多巴胺的食品后，会产生心跳过快、心慌、不由自主的颤抖、双脚站不住、心悸胸闷、四肢肌肉颤动、头晕乏力等神经中枢中毒后失控的现象，甚至导致死亡。这种含量过大或无病用药的中毒，尤其对高血压、心脏病、糖尿病、前列腺肥大、甲亢患者的危险性更大。慢性摄入，还会导致儿童性早熟，能使人体组织致癌致畸。由于莱克多巴胺的熔点高，160℃以下的温度不足以改变其性质，所以一般的食品加热不能破坏其作用。引起中毒的潜伏期在20分钟到4小时之间。

（作者：河南出入境检验检疫局技术中心 魏蔚 杨冀州   郑州大学化学系 祝伟霞）