中国质量新闻网
您当前位置: 新闻中心>>财经>>综合时讯>>

【通关监管】海关技术规范解读 | 国境口岸恙虫病东方体实时荧光PCR检测方法

2021-10-13 10:06:34 12360海关热线

2021年6月18日,中华人民共和国海关总署发布了2021年第45号公告。关于《进口再生钢铁原料检验规程》等76项行业标准发布,其中《国境口岸恙虫病东方体实时荧光PCR检测方法》SN/T 5332-2021自2022年1月1日起实施,本文对该行业标准进行解读。

海关总署公告2021年第45号及附件

一、恙虫病是什么

恙虫病由恙虫病东方体引起,以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病。临床上以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征。我国古代称恙虫病为沙虱热,广东称为元宝疮、爪子疮,福建平潭称三阳病,浙江永嘉称杨梅病、六月客等。

自我国广东省报告首例恙虫病病例以来,恙虫病疫区已由海南、广东、福建、浙江等省区扩展到山东、江苏、山西、黑龙江、吉林、辽宁以及天津等省市。2006年报告恙虫病病例数1244例;2007年报告1332例、死亡1例;2008年报告2592例、死亡3例,恙虫病流行呈上升趋势。研究表明,已有10属21种鼠类自然感染恙虫病东方体,恙虫病已经成为我国重要的鼠源性自然疫源性疾病,对人类健康构成极大威胁。

二、检测对象是什么

本标准检测对象包括国境口岸及出入境交通工具、集装箱、货物、行李等场所采集的鼠类样品,国境口岸疑似恙虫病患者的临床样品。

鼠类是出入境交通工具中常见的病媒生物之一,可随飞机、轮船等载体在国境口岸之间扩散。历史上多次发生由于鼠类入境造成疫病暴发流行的事例。1898年,一艘汽船将染有鼠疫耶尔森菌的褐家鼠(Rattus norvegicus)从印度带到了马达加斯加岛,褐家鼠在该岛大量繁殖,使当地鼠疫频繁发生。近年来,我国卫生检疫机构在北京、上海、宁波、成都等口岸的入境飞机、轮船、集装箱中查获大量的鼠类。

鼠类的输入对我国国境口岸的卫生安全构成严重威胁,国境口岸是防范病媒生物输入的第一道防线。加强对出入境交通工具及集装箱、货物等的排查和对输入性鼠类携带病原体的监测检测,是有效防止传染病通过口岸输入、输出,避免疫情大范围暴发的基础和前提,也是国境口岸检疫执法和疾病监测的迫切需要。

三、本标准中检测方法

本标准采用实时荧光PCR检测方法对待检样品进行检测。参考恙虫病东方体Karp、Gilliam、Kato血清型56-kDa蛋白基因序列,设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针,扩增片段大小为130 bp。

以Karp型基因序列(GI:63079111)为例,对引物扩增区域核酸序列分别向两侧外延,构建质粒作为阳性对照。适当稀释,当检测Ct值在20~35之间,进行分装备用。

序列如下:

GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。

四、标准方法检测条件及系统评价情况

实时荧光PCR反应体系

以LightCycler 480I 型实时荧光定量PCR仪器为例,反应条件如下:

50 ℃ 2分钟;95 ℃ 10分钟;95 ℃ 15 秒,60 ℃ 1分钟,循环45次,退火时收集荧光信号。荧光通道为FAM。由于不同实时荧光定量PCR仪性能有差异,可根据实际仪器型号,对检测程序略作调整。

1

敏感性及线性评价情况

本标准提供的恙虫病东方体实时荧光定量PCR检测方法,定量关系曲线线性拟合系数R²=0.9988,检测敏感性为54.5个拷贝。

敏感性扩增曲线图

定量关系曲线

2

特异性及重复性评价

本标准提供检测方法与莫氏立克次体(R.mooseri)、普氏立克次体(R.prowazekii)、立氏立克次体(R.brasiliensis)、Q热立克次体(C.burnetii)、嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophi)及伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)无交叉反应。批内及批间重复性变异系数均小于5%。

特异性试验扩增曲线

重复性实验结果

五、结果判读

1

质量控制

有效实验应同时满足如下条件:

—— 阳性对照有扩增曲线,且Ct值≤35;

—— 阴性对照及空白对照无Ct值,或Ct值≥40,且无扩增曲线。

2

阴性结果

在有效实验条件下,待检样品Ct值≥40,且无典型扩增曲线,判为阴性,报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性(实时荧光PCR法)。

3

阳性结果

在有效实验条件下,阳性结果判断及报告如下:

—— 待检样品Ct值≤35,且出现典型扩增曲线,判为阳性,报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性(实时荧光PCR法);

—— 如待检样品35<Ct值≤40,且出现典型扩增曲线,需要复检,复检后Ct值仍在35~40之间,且出现典型扩增曲线,判为阳性,报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性(实时荧光PCR法)。否则判为阴性,报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性(实时荧光PCR法);

—— 如待检样品40<Ct值≤45,且出现扩增曲线,建议采用浓缩方式处理核酸样品后复检,复检后Ct值有明显减小趋势,且扩增曲线有典型对数增长期,判为阳性,报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性(实时荧光PCR法),此类样品建议采用其他检测方法进行确认。否则判为阴性,报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性(实时荧光PCR法)。

六、生物安全及防污染要求

生物安全应遵循GB 19489和WS 233 中相关规定,本方法中恙虫病东方体实时荧光PCR检测应在生物安全2级(BSL-2)实验室内进行;PCR防污染要求应遵循WS/T 230中相关规定。

(责任编辑:六六)
最新评论
声明:

本网注明“来源:中国质量新闻网”的所有作品,版权均属于中国质量新闻网,未经本网授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:中国质量新闻网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。若需转载本网稿件,请致电:010-84639548。

本网注明“来源:XXX(非中国质量新闻网)”的作品,均转载自其他媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。文章内容仅供参考。如因作品内容、版权和其他问题需要同本网联系的,请直接点击《新闻稿件修改申请表》表格填写修改内容(所有选项均为必填),然后发邮件至 lxwm@cqn.com.cn,以便本网尽快处理。

图片新闻
  • 半山终章 至此再无

  • 金塔胡杨醉游人

  • 江苏省南京市全面开展“质量月”活动 ...

  • 重庆市涪陵区清溪镇市场监管局开展“ ...

  • “深圳标准”认证体系树立以高标准引 ...

最新新闻