关于《菌落总数测定》若干问题的建议

    ■文/王 琪

    本文对食品安全国家标准《菌落总数测定》进行了深入的探讨，提出了其中存在的问题和相应的建议，以便改进《菌落总数测定》检验方法的标准，从而提高菌落总数测定的科学性和准确性。

    GB4789.2-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》是GB/T4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的替代标准，于2010年3月26日发布，自2010年6月1日起实施。该标准比原标准有了较大的改进，但仍存在若干问题值得探讨。本文现就这些问题提出自己的浅见，以期与同行商榷。

    样品的稀释

    1 10样品匀液的稀释方法

   对于固体和半固体样品的稀释，该标准规定了两种稀释方法，即称取25g样品放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水（以下简称稀释液）的无菌均质杯或均质袋内，可以使用无菌均质杯或均质袋两种稀释容器。而对于液体样品，该标准仅规定了一种稀释方法，即吸取25mL样品放入盛有225mL稀释液的无菌锥形瓶（瓶内预置适量的无菌玻璃珠）中，未规定可使用无菌均质袋。

   由于无菌锥形瓶（瓶内预置适量的无菌玻璃珠）的准备和使用均不方便，而无菌均质袋（与均质器配合）的购置和使用都很方便，现已广泛应用。因此，对于液体样品的稀释，建议增加无菌均质袋的使用。

    1 100(及以上)样品匀液的稀释方法

    该标准规定，在吸取1mL110（及以上）的样品匀液加入到盛有9mL稀释液的无菌试管中后，“振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀”。其中的“换用1支无菌吸管反复吹打”可能造成正在制备的样品匀液的外源性污染。在检验时，用吸管吹打液体则必需配合使用小型洗（吸）耳球，通过多次挤压与吸管相连的洗（吸）耳球而吹打液体。由于洗（吸）耳球在检验室内长期多次使用而普遍存在严重污染，且检验人员难以做到在每次使用前都对该洗（吸）耳球进行灭菌处理。因此，建议删除“换用1支无菌吸管反复吹打”，将“振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀”改为“振摇试管其混合均匀”。

    菌落总数的计算方法

    该标准规定，若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，按公式（1）N = ΣC /(n1 + 0.1n2) d来计算菌落总数。该公式在应用时存在两个问题：一是该公式是个通用公式，未进行应有的简化；二是d的含义未解释清楚。

    由于该标准规定每个稀释度的样品匀液都接种2个平板（平行样）进行培养，即公式中的n1和n2都是2，因此，建议将该公式写作N = ΣC / (n1 + 0.1n2) d =ΣC /2.2d，使其逻辑清晰，便于理解和应用。

    另外，该标准将公式中的d解释为“d —稀释因子（第一稀释度）”。它仅解释d为稀释因子，并未给出稀释因子的定（含）义。检验人员只能通过该标准所列的“示例”来判定其定（含）义。因此，建议增加稀释因子的定（含）义。

    菌落总数的报告

   该标准规定了所有稀释度（100、10-1、10-2、10-3……）的平板均无菌落的报告方式［<（1×稀释倍数）CFU/g（mL）］，但未规定最低稀释度（100或10-1）的两个平板上的菌落数分别为0和1CFU的报告方式。在日常检验中，这种情况是时常出现的。因此，应该增加这种情况的报告方式。

    就这种情况而言，由于两个平板上的菌落数的平均数为（1+0）/2 = 0.5 ≈ 1，有人因此报告为“1或（1×稀释倍数） CFU/g（mL）。实际上，由于（1+0）/2 = 0.5 <1，因此建议也规定为按“< 1或(1×稀释倍数)CFU/g（mL）”来报告。

    质量控制

   该标准规定了一些重要的质量控制措施和要求，如培养箱温度的变化范围、天平和吸管的精度，以及设置空白对照等，但还缺乏对检验环境（检验室）的质量控制要求。美国食品药品监督管理局（FDA）的细菌学分析手册（BAM）中的好气性平板计数（AerobicPlateCount）所要求的环境条件包括洁净度、光照强度和通风，其中工作区的微生物密度（平板沉降法沉降15min）不超过15CFU/板。因此，建议增加对检验环境，尤其是检验室空气洁净度的要求，以加强对检验环境的质量控制。

    文字表述

    菌落总数的定义

   该标准将菌落总数定义为“食品检样经过……所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数”。其中的“微生物”不够确切。

   微生物通常包括细菌、真菌（霉菌和酵母）、病毒、原生动物等微小生物。在实际检验工作中，平板计数琼脂平板上有时也会出现霉菌的菌落。但由于霉菌（和酵母）的菌落数是另行检测的，当在计数平板上出现霉菌的菌落时，检验人员通常也仅查计细菌的菌落数。因此，建议将菌落数的定义改为“食品检样经过……所得每g（mL）检样中形成的细菌的菌落总数”

    样品的稀释之表述

   （1）标准中6.1.1和6.1.2款的“置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的……”的表述不符合语法，均应改为“置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的……”。

   （2）标准中6.1.5款的“空白稀释液”无明确定（含）义，检验人员根据上下文猜测其中的“稀释液”应为磷酸盐缓冲液或生理盐水，但将“空白”二字加在之前又使其语义不明，纯属于多余。建议将“空白稀释液”改为“所用的磷酸盐缓冲液或生理盐水”。

    培养之表述

   标准中6.2.1款的“36℃±1℃培养48h±2h”应改为“置于36℃±1℃（条件下）培养48h±2h”，“水产品30℃±1℃培养72h±3h”应改为“水产品的检测培养方式为30℃±1℃培养72h±3h”。

    菌落计数之表述

    其中的“菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits,CFU）表示”应改为“菌落计数结果的单位以菌落形成单位（colony-formingunits,CFU）表示”；其6.3.2款中的“而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数”显然存在语法错误，应改为“而应以无片状菌落生长的平板来查计该稀释度的菌落数”或“而应以无片状菌落生长的平板上的菌落数作为该稀释度的菌落数”。

    （作者单位：河南省郑州市质量技术监督检验测试中心）

    《中国质量技术监督》2012年9月刊