在食品检验工作中,由于在现行标准GB/T5009.29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》和GB/T23495-2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定高效液相色谱法》中没有明确描述食醋、酱油和面酱中苯甲酸和山梨酸的液相色谱法的样品处理方法,对检验工作有一定的影响。作者在日常的检测工作中,摸索出了一种简便可行的样品前处理方法。
1.材料方法
1.1设备材料:天美LC-2000液相色谱仪、柱温箱、台式高速离心机、电子分析天平、50mL比色管、0.45微米水相用针筒式过滤器、10mL医用注射器、1.5mL塑料离心管、pH广泛试纸。
1.2试剂
1.2.1水:一级水。
1.2.2甲醇:色谱纯。
1.2.3乙酸氨溶液:称取1.54g乙酸铵,溶解后用水定容于1000mL容量瓶中,混匀。
1.2.4亚铁氰化钾溶液:称取亚铁氰化钾106.0g,加适量水加热溶解,冷却后用水定容于1000mL容量瓶中,混匀。
1.2.5乙酸锌溶液:称取乙酸锌220.0g,加适量水加热溶解,冷却后加入30mL冰乙酸,用水定容于1000mL容量瓶中,混匀。
1.2.6氢氧化钠溶液(0.5mol/L):称取氢氧化钠20.0g,加水溶解,冷却至室温后定容于1000mL容量瓶中,混匀。
1.2.7硫酸溶液(0.5 mol/L):吸取浓硫酸15mL缓慢加入约250mL水中,同时不断搅拌,冷却至室温后,定容于500mL容量瓶中,混匀。
1.2.8碳酸氢钠溶液:称取2g碳酸氢钠(优级纯),加水至100mL,混匀。
1.2.9苯甲酸标准储备溶液:准确称取0.1000g苯甲酸,加碳酸氢钠溶液5mL,加热溶解,移入100mL容量瓶中,加水定容至100mL,苯甲酸含量为1.0mg/mL,作为储备溶液。
1.2.10山梨酸标准储备溶液:准确称取0.1000g山梨酸,加碳酸氢钠溶液5mL,加热溶解,移入100mL容量瓶中,加水定容至100mL,山梨酸含量为1.0mg/mL,作为储备溶液。
1.2.11苯甲酸和山梨酸混合标准使用溶液:吸取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各10.0mL,放入100mL容量瓶中,加水至刻度。此溶液含苯甲酸和山梨酸各0.100mg/mL。经0.45μm滤膜过滤后待用。
1.2.12将混合标准使用液(各0.1mg/mL)分别吸取0.5mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL、25.0mL和 50.0 mL于50 mL 容量瓶中,用水定容、混匀,配制成浓度分别为0.001 mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04 mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL后,分别进样,绘制工作曲线。
2.液相色谱条件
2.1色谱柱:AE.KromasilC18反相液相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。
2.2 流动相混合比:甲醇 乙酸铵溶液=10 90。
2.3 流速:1.0mL/min。
2.4 进样体积:10μL。
2.5 检测器波长:230nm。
2.6 柱温:30℃。
根据苯甲酸和山梨酸保留时间定性,外标法(多点法)峰面积定量。
3.样品处理
称取食醋、酱油和面酱5.0g(精确至0.1mg)于50mL比色管中,加水20mL,吸取氢氧化钠溶液调节样液pH值为8,若pH值大于8时,可用硫酸溶液反调。再加入亚铁氰化钾溶液2mL,加盖摇匀,最后加入乙酸锌溶液2mL,加盖振摇,静止约10分钟至泡沫消失,用水定容至50mL,混匀。转移适量处理液于50mL离心管中,经10000转/分、5min离心沉淀处理,再用注射器吸取离心管上清液经针筒式过滤器过滤于1.5mL塑料离心管中,上机待测。
4.结果讨论
4.1一般情况下,在这三类食品中,苯甲酸和山梨酸主要是其水溶性盐(钠盐、钾盐)存在,又由于食醋、酱油和面酱都属发酵法生产,成分比较多,它们都含有少量的游离蛋白质,都呈酸性,通过调节样品pH值至近中性、沉淀蛋白、离心分离、微膜过滤操作后就可上机检测。
4.2在判断样液的pH时采用广泛试纸即能满足实验要求,操作简单、方便、直观,用酸度计判别样液的pH操作繁琐;在调节样液pH时使用了氢氧化钠溶液和硫酸溶液,其对实验没有影响。
4.3在实际检测中,可将标准中推荐的甲醇和乙酸铵的比例由5+95提高到10+90,有利于较好较快完成实验,该条件下目标峰附近没有杂质峰影响、分离度好(大于1.5,约为2.9),且苯甲酸和山梨酸可在16分钟内完成(苯甲酸保留时间约为8.7min、山梨酸保留时间约为11.5min)。
4.4 该方法的工作曲线方程:在浓度为0mg/mL~0.1mg/mL范围内,防腐剂的浓度C和峰面积A呈良好的线性关系。
4.5方法的回收率和精密度(见表2)。以不含苯甲酸和山梨酸的食醋为对象,进行加标回收试验。
苯甲酸加标回收率在99.4%~104.0%,山梨酸加标回收率在95.6%~96.1%,该方法准确度高,可满足实验室实际检测需要。
5.结论
该液相色谱法的样品前处理方法简单可行,可保证实验室实际的日常检测需求。
(作者单位:甘肃省平凉市产品质量监督检验所)