用HPLC检测奶粉中三聚氰胺的体会

       三聚氰胺之害，不但给人民身心造成伤害，也对当前食品安全监管网络提出了新的挑战。在“三聚氰胺事件”愈演愈烈并最终波及整条食物链的时候，如果质量检验仅仅只是沿用在老的工作方法和原有的检测手段显然已经难以满足检测需求。另外，政府对于国家食品安全质量的高度重视，进一步催化了更加快捷、准确的检测手段的开发过程。

   湖北省仙桃市产品质量监督检验所在奶粉的三聚氰胺检测过程中经历了三个阶段。从2008年9月三聚氰胺事情开始的第一阶段，我所作为基层质检所还只能按照《乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定》（GB/T21704-2008）对辖区内的乳制品生产企业进行监控，本来正规严格的乳与乳制品营养测定应该是检测待检样品中的真实蛋白质含量，这在发达国家就是测定所谓的纯蛋白(或称真蛋白)，且被中国采用为食品工业的日常标准检测方法。

   食品或饲料中测定纯蛋白，也是检测牛奶氮含量的国家标准所要求的。其实，它就是把凯氏定氮法做了些改进，包括中国的实验室在内都已经应用很多年了。本法所指的纯蛋白，同样是测出食品中的含氮量×6.25来计算。它是通过分离掉样品处理液中的非蛋白质氮，测定剩下的真蛋白氮来实现的。实际上只要多一道步骤：先用三氯乙酸处理样品处理液。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀的氮含量，就可以知道蛋白质的真正含量，需要的话还可以测定滤液中冒充蛋白质的氮含量。如果早按这种方法检测，食品和饲料中用非蛋白质的三聚氰胺之类冒充的假蛋白就无所遁形了。但是，这种方法有很大的弊端，就是不能快速准确地定性和定量。

   第二阶段，是在没有国家标准检测方法之前，为了能快速准确地给待检乳与乳制品中的三聚氰胺定性和定量，我所借鉴了兄弟单位的经验，自己开始摸索开发乳与乳制品中的三聚氰胺的检测方法，即三聚氰胺HPLC-UV检测法。

   原理：样品经0.1%甲酸水溶液和甲醇沉淀蛋白并定容，用反相高效液相色谱法-紫外可见光检测器进行色谱分析测定。三聚氰胺的检出限为2mg/KG。

   试剂：甲酸、甲醇、甲醇（色谱纯）庚烷磺酸钠（25g/瓶）、柠檬酸、0.1%甲酸、0.1%甲酸和甲醇溶液（1：1）、柠檬酸和庚烷磺酸钠溶液。

   仪器和设备：高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。分析天平：感量为0.0001g和0.01g。离心机：转速不低于 4000r/min。 超声波水浴。涡旋混合器。具塞塑料离心管。

    试样制备：贮藏在冰箱中的乳与乳制品，应在试验前预先取出，并达室温。液态试样制备准确称取试样10g，精确至0.0001g，置于预先已称量的烧杯中。固态试样制备准确称取试样5g，精确至0.001g。

   样品前处理步骤：取2g样品（0.01）置于25mL比色管中，加5mL0.1%甲酸（3.6）振荡5分钟。再加5mL甲醇后超声提取15分钟，振荡提取10min后，加甲醇定容到刻度（V）。 以不低3000r/min离心15min。取清液经润湿的滤纸过滤后，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

    检测：三聚氰胺检测方法:色谱柱：C184.6×250mm。流动相：甲醇+柠檬酸庚烷磺酸钠（30+70）进样量：20uL。流速：1.0mL/min。柱温：室温或40℃。波长：240nm。本方法的平均回收率大于90%，RSD小于3.0%，线性范围为1mg/L～100mg/L。

   在第三阶段，2008年10月国家颁布了22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》以后，我所在认真学习和正确理解国家标准情况下，开始了第三阶段三聚氰胺的检测方法如下。

   仪器与条件：ULTIMATE3000高效液相色谱仪(美国，戴安公司)；二极管阵列检测器(DAD)，检测波长240nm；柱温：40℃。DIONEXC18(4.6×250mm)；缓冲液：10mM柠檬酸，10mM庚烷磺酸钠；流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min。离子交换固相萃取柱PCX60mg/3mL。

   试剂与样品试剂:甲醇、乙腈；氨水、乙酸铅、三氯乙酸；三聚氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠(Sigma公司)；甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。样品：奶粉。

    检测方法（三聚氰胺HPLC-UV检测）：

    1．样品前处理

   提取：称取奶粉样品5g，加入50ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声20min。然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3mL过混合型阳离子交换小柱(PCX)净化(PCX小柱，60mg/3mL)。活化及平衡：3mL甲醇，3mL水。

   上样：加入提取液3mL。淋洗：3mL水；3mL甲醇弃去淋洗液并将小柱抽干。洗脱：5mL5%氨化甲醇(v/v)洗脱(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析。

    2．检测

   样品经均质，1％三氯乙酸溶液提取，用固相萃取小柱净化，减压浓缩后以甲醇溶解定容，三聚氰胺的HPLC测定方法。色谱柱：DIONEXC18(4.6×250mm)；标准：国家标准方法；缓冲液：10mM柠檬酸，10mM庚烷磺酸钠；流动相：缓冲溶液:乙腈=90:10；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；波长：240nm。平均回收率大于90%，RSD小于3.0%，线性范围为1mg/L～100mg/L。

   第二阶段和第三阶段两种高效液相色谱法(HPLC)测定三聚氰胺的结果分析及体会：在第二阶段的检测中，我们样品处理过程简便，出峰时间快。缺点是样品中的杂质如果太多，就会对三聚氰胺的准确定性产生影响，从而产生误判。特别是现在市场上的很多奶粉都添加了蛋白糖，采用以上方法进行检测，蛋白糖中有干扰物质,出峰时间和三聚氰胺的出峰时间非常接近，对准确检测形成了很大的障碍。在第三阶段我们按照国家标准进行阳离子交换反相萃取柱净化样品提取液，结合高效液相色谱对乳与乳制品中三聚氰胺进行测定,获得较满意的结果。三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，我们按照国家公布的三聚氰胺检测方法，可以得到良好的分离效果。

    结论：

   1．可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度，批次重复性好。

    2．检测过程更加科学：三聚氰胺可得到良好的保留与分离，避免了复杂过程。

    3．有效地降低了杂质对检测结果的影响，提高了检测的灵敏度，延长了色谱柱的使用寿命。

    （作者单位：湖北省仙桃市产品质量监督检验所）