专家详解荧光定量PCR仪开展病毒检测工作的原理和计量知识

守护好新冠病毒检测的“透明屋”

专家详解荧光定量PCR仪开展病毒检测工作的原理和计量知识

□ 本报记者 张文礼

近期，新冠病毒感染的肺炎疫情牵动着全国人民的心。当前，打赢疫情防控阻击战进入关键时期，快速完成疑似病例确诊，成为最为关键的工作之一。

要快速精确地完成确诊工作，检测设备和仪器成为重要的前提。那么，新冠病毒是如何确诊的？检测设备是如何做到精确测量的？设备不准确会造成什么后果？近日，围绕这些问题，记者采访了南京市计量监督检测院（以下简称南京市计量院）总工程师胡宁、医疗器械部副部长陈鸿飞。

确诊病毒这两种设备必不可少

据胡宁介绍，要检测出新冠病毒，首先需要病毒核酸检测试剂盒。由于核酸检测试剂盒需要针对特定的病毒进行单独研发生产，这就造成了在疫情前期确诊病例较少、而后期确诊病例直线上升。同时，要做到最终检测确诊病毒，就需要使用到实时荧光定量PCR仪，该设备能否检测确诊病毒的关键，其工作状态如何，将直接影响病毒检测的效率和精准度。

记者了解到，荧光定量PCR仪作为确诊新冠病毒的定量分析仪器，对新冠病毒的检测确认至关重要，且病毒检测对设备精度要求比较高。同时，由于荧光定量PCR仪设备价值较高（最便宜的荧光定量PCR仪约30万元，最高级的将近100万元），一般只有省市一级疾控中心、大中城市的三级医院等机构才拥有，且检测工作必须是国家相关部门指定的较高级别的、具有资质的生物安全实验室得到的数据才能被认可，这也从一个方面导致了前期病例确诊较慢。

计量人员对荧光定量PCR仪进行检定校准

那么，荧光定量PCR仪在病毒的快速确诊方面能起多大作用呢？据陈鸿飞介绍，根据国家卫健委发布的《新冠肺炎诊疗方案（试行第四版）含最新中医诊疗方案》，实时荧光RT-PCR检测被列为确诊病例的两种方法之一，而且凭借时间短、成本低等特点，已成为应用最广的确诊新冠病毒的方法。

仪器不准会直接导致病毒误测

针对荧光定量PCR仪进行病毒检测的流程问题，陈鸿飞介绍说，首先，由实验室在病人呼吸道样本或血液样本中分离出的病毒进行处理，提取出病毒核酸这一特定的“身份证”（病毒基因序列）。其次，将病毒核酸与试剂盒内各组分混合形成完整的RT-PCR反应体系，放入荧光定量PCR仪后，进行荧光定量PCR反应，根据实时监测反应的荧光曲线来判定是否为新冠病毒。

按照陈鸿飞的介绍，在具体操作中，检测人员会将提取病人的核酸样本和试剂盒配比好之后，放到荧光定量PCR仪中进行PCR反应，通过温度的升降，病人样本中的新冠病毒核酸会被特异性的引物探针识别，从而进行快速复制，导致其荧光信号倍增，仪器会检测到相应呈倍数扩增的曲线，并以此来最终确诊病人样本中是否含有新冠病毒。也就是说，荧光定量PCR仪更像是一间“房屋”——一间为病毒和试剂盒中试剂提供反应体系、可以进行详细观察的“透明屋”。

“荧光定量PCR仪检测中的误差随时都会导致误诊情况的出现，必须要确保其检测的可靠性。”陈鸿飞说：“比如在温度控制的时候，按照标准要求温度准确度误差要求在±0.5℃之内，温度均匀性误差不大于1.0℃。如果温度误差过大，比如超过1.0℃甚至更大的话，会造成本来应该进行的PCR扩增反应无法正常进行或是扩增效率降低，此时应该显示阳性的样本荧光曲线会呈现出假阴性，直接导致对病毒的误测，造成严重的后果。荧光检测模块如果有问题，会导致仪器无法检测到正确的荧光信号，也同样会导致仪器得到病人样本错误结果。”

计量工作提供重要技术支撑

荧光定量PCR仪在病毒检测确诊中扮演了如此重要的作用，其自身的精准可靠便显得愈加重要。而要实现这个目标，计量工作在其中起到了重要的技术支撑作用。

此次新冠肺炎疫情发生后，南京市疾控中心紧急报检，请求南京市计量院对该中心的4台荧光定量PCR仪进行检定校准。

胡宁告诉记者，由于使用该仪器的都是处在防疫一线的部门，所以在检定工作中一定要确保人员的绝对安全和仪器的准确可靠。接到报检请求后，南京市计量院围绕南京市疾控中心快速检定、精准检定的实际需要，优化流程，快速响应，派出精兵强将，在最短的时限内完成了检定工作。

记者了解到，荧光定量PCR仪检定校准过程有一套严格规范的流程要求，需要按照国家主管部门出台的JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》计量技术规范进行校准。

据陈鸿飞介绍，荧光定量PCR仪检定主要分两个部分，一个是温度检测，另一个是荧光检测，其检测都需要专门的设备。在温度检测时，计量人员使用高精度的荧光定量PCR仪专用温度检测设备，该设备包含15个温度检测探头，能完全贴合仪器的加热模块，按照误差标准，温度检测的不确定度要小于0.1℃。同时，荧光检测时需要使用国家核酸标准物质，该标准物质覆盖了（102～108）拷贝数的核酸样本，可以全面评价荧光定量PCR仪荧光检测性能。

“按照规范要求，目前全国已经实现建标、能够完成荧光定量PCR仪校准的计量机构不超过10家。”据胡宁介绍，南京市计量院拥有批准建设的唯一国家级生物技术药物产业计量测试中心，且该院和计量“国家队”——中国计量科学研究院一直保持密切的合作，在该领域具备较强的科研和技术能力，能够严格按照规范要求完成校准工作。

此次检定校准工作由陈鸿飞和一名同事共同完成。陈鸿飞说，一台荧光定量PCR仪荧光部分检测需要一个半小时左右，温度部分检测需要半个小时左右。检定中，他和同事对南京市疾控中心的荧光定量PCR仪温度参数进行了修正，对荧光部分的核酸样本偏差、样本线性等参数给出了综合评价，并出具了校准证书，校准工作得到了南京市疾控中心的高度肯定和认可。

“计量部门的工作，就是要通过高效快速优质的检定校准，让仪器更加准确、数据更加可靠、质量控制更好、更加快速地实现新冠病毒的检测确认，为打赢疫情防控阻击战作出计量人的贡献。”胡宁说。

《中国质量报》